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对CRISPR-Cas9工具的新理解可以改善基因编辑

在短短八年内,CRISPR-Cas9成为基础研究和基因治疗的首选基因组编辑器。但是CRISPR-Cas9还产生了其他潜在强大的DNA操作工具,可以帮助修复导致遗传性疾病的基因突变。

加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员现在已经获得了这些工具中最有前途的工具的第一个3D结构:碱基编辑器,该编辑器与DNA结合,而不是切割,而是将一个核苷酸精确地替换为另一个。

最初创建于4年前的碱基编辑器已用于尝试纠正人类基因组中的单核苷酸突变。现在可用的基础编辑器可以解决所有已知遗传疾病中的60%,可能是仅1个核苷酸的突变引起的,可能超过15,000种遗传性疾病。

在7月31日的《科学》杂志上报道了详细的3-D结构,该结构提供了一个路线图,用于调整基本编辑器,使它们在患者中的使用更加通用和可控。

加州大学伯克利分校的博士后研究员加文·诺特(Gavin Knott)说:“我们能够首次观察到一位基本的编辑在行动。” “现在,我们不仅可以了解何时可以使用,什么时候不可以使用,还可以设计下一代基础编辑器,使它们变得更好,更适合临床。”

基本编辑器是一种Cas9融合蛋白,它使用了部分失活的Cas9-剪断剪被禁用了,因此只能剪切一条DNA链;还有一种酶,例如,可以激活或沉默基因,或修饰相邻区域DNA。由于这项新研究报告了Cas9融合蛋白的第一个结构,因此可以帮助指导众多其他基于Cas9的基因编辑工具的发明。

“实际上,我们第一次看到基本编辑器充当两个独立的模块:您拥有提供特定性的Cas9模块,然后具有为您提供活动的催化模块,”前UC Berkeley的Audrone Lapinaite说博士后研究员,现为坦佩亚利桑那州立大学的助理教授。“从这个基础编辑者那里得到的结构绑定到它的靶标上,实际上为我们提供了一种思考Cas9融合蛋白的方法,使我们知道了Cas9的哪个区域更适合融合其他蛋白。”

Lapinaite和Knott最近是澳大利亚莫纳什大学(Monash University)的研究员,并且是该论文的第一作者。

2012年,研究人员首次展示了如何重新构建细菌酶Cas9,并将其转变为从细菌到人类的所有类型细胞的基因编辑工具。CRISPR-Cas9是加州大学伯克利分校生物化学家詹妮弗·杜德纳(Jennifer Doudna)和她的法国同事Emmanuelle Charpentier的创意,数十年来首次改变了生物学研究并将基因治疗带入临床。

科学家很快选择了Cas9来生产其他一系列工具。基本上,Cas9是蛋白质和RNA的混合物,它精确地靶向特定的DNA片段,然后像一把剪刀一样精确地将其剪断。剪刀的功能可以被破坏,但是,允许Cas9靶向并结合DNA而无需切割。这样,Cas9可以将不同的酶运送到DNA的目标区域,从而允许这些酶操纵基因。

2016年,哈佛大学的David Liu将Cas9与另一种细菌蛋白结合在一起,以外科方式精确地将一个核苷酸替换为另一个核苷酸:第一位基础编辑。

早期的腺嘌呤基础编辑器运行缓慢,而最新版本的ABE8e却令人眼花blind乱:它在15分钟内完成了将近100%的预期基础编辑。但是,ABE8e可能更倾向于在试管中编辑意外的DNA片段,从而可能产生所谓的脱靶效应。

新发现的结构是通过称为低温电子显微镜(cryoEM)的高能成像技术获得的。活性分析表明了为什么ABE8e易于产生更多脱靶编辑的现象:与Cas9融合的脱氨酶蛋白始终处于活跃状态。当Cas9在细胞核周围跳跃时,它会结合并释放数百或数千个DNA片段,然后才能找到其预期的靶标。附加的脱氨酶就像是一门松散的大炮,不会等待完美的匹配,并且经常在Cas9停在其最终目标上之前编辑一个碱基。

知道效应子结构域与Cas9如何连接可以导致重新设计,该重新设计仅在Cas9找到其靶标后才使酶具有活性。

“如果您真的想设计真正特异性的融合蛋白,则必须找到一种使催化结构域更多地成为Cas9一部分的方法,以便它能够感知Cas9何时位于正确的靶标上,然后才被激活,而不是被激活。一直都很活跃。”拉皮奈特说。

ABE8e的结构还指出了脱氨酶蛋白的两个特定变化,使其比基础编辑器的早期版本ABE7.10更快地工作。这两个点突变使蛋白质能够更紧紧地抓住DNA,并更有效地将G替换为A。

纳特补充说:“作为结构生物学家,我真的很想研究一个分子,并思考合理改进它的方法。这种结构以及伴随的生物化学确实为我们提供了这种力量。” “我们现在可以为该系统在细胞中的行为做出合理的预测,因为我们可以看到它并预测它将如何破裂或预测使其变得更好的方式。”

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